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Jan 02, 2024

Modificazione e preparazione efficienti del DNA circolare per l'espressione in colture cellulari

Communications Biology volume

Biologia delle comunicazioni volume 5, numero articolo: 1393 (2022) Citare questo articolo

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I plasmidi del DNA sono uno strumento essenziale per la consegna e l'espressione di RNA e proteine ​​negli esperimenti di coltura cellulare. La preparazione dei plasmidi comporta tipicamente un laborioso processo di clonazione, validazione e purificazione batterica. Sebbene i plasmidi di espressione possano essere progettati e ordinati dai produttori a contratto, il costo può essere proibitivo quando è richiesto un gran numero di plasmidi. Abbiamo sviluppato un metodo e un protocollo efficienti e completamente sintetici che consentono la produzione di DNA circolarizzato contenente elementi di espressione pronti per la trasfezione in sole 3 ore, eliminando così le fasi di clonazione batterica. Il protocollo descrive come prendere un frammento di DNA lineare a doppio filamento e circolarizzarlo e purificarlo in modo efficiente con un tempo pratico minimo. Come prova del principio, abbiamo applicato il vettore circolare che esprime l'RNA guida di editing primario ingegnerizzato (epegRNA) nella coltura cellulare e abbiamo dimostrato la corrispondenza e persino le prestazioni superiori di questo metodo rispetto alle guide espresse dai plasmidi. La velocità di preparazione, il basso costo e la facilità d'uso del metodo lo renderanno uno strumento utile nelle applicazioni che richiedono l'espressione di RNA e proteine ​​brevi.

Esistono molte tecniche per la preparazione e il rilascio di RNA e proteine ​​per l'espressione transitoria in colture cellulari1. In questo studio presentiamo un metodo di preparazione nuovo ed efficiente. A titolo dimostrativo, descriveremo l'uso del nostro metodo nel contesto dell'applicazione dell'editing genetico. Tuttavia, poiché il principio alla base di questo metodo è generico, questo metodo può essere utile per una varietà di scopi e applicazioni che richiedono l'espressione di RNA e proteine. Anche se discuteremo l'implementazione specifica per l'editing genetico e confronteremo il nostro metodo con alcune tecniche di preparazione esistenti, l'obiettivo di questo articolo è presentare un nuovo approccio alla preparazione dei vettori di espressione in un ambiente di laboratorio e non un metodo di editing genetico più efficiente come come.

I tre approcci più consueti che facilitano l'editing genetico quando consegnati nelle cellule sono: (I) plasmidi singoli o multipli2 che codificano Cas9 e altre proteine ​​supplementari e implementazioni di RNA guida adatte per CRISPR/Cas9 tradizionale, editing di base, editing prime o altri metodi3,4 ,5,6; (II) mRNA Cas9 e guida RNA7; (III) Proteina Cas9 complessata con RNA guida8. Attualmente vengono utilizzati diversi metodi di somministrazione dei suddetti costrutti di editing genetico. La scelta del metodo di consegna dipenderà dai requisiti specifici e dalle preferenze del ricercatore, che possono includere elettroporazione9,10, lipofezione11, trasfezione fisica diretta12, consegna di vettori su particelle polimeriche e microcarrier13 e modalità dei metodi sopra menzionati.

L'approccio (I), l'editing genetico mediante trasfezione di plasmidi per l'espressione transitoria, è comunemente usato grazie alla sua semplicità concettuale, facilità di gestione e stabilità dei plasmidi. Tuttavia, la preparazione dei plasmidi è un processo che richiede molto tempo e manodopera e che in genere richiede 2 giorni2 (fare riferimento alle fasi tipiche di clonazione batterica nella nota supplementare 1).

Abbiamo sviluppato un metodo e un protocollo efficienti e completamente sintetici che consentono la produzione di DNA circolarizzato contenente elementi di espressione pronti per la trasfezione in sole 3 ore, eliminando così le fasi di clonazione batterica. Il DNA circolarizzato è resistente alla degradazione dell'esonucleasi nel citoplasma14. Il DNA lineare manca di tale stabilità, il che rappresenta un ostacolo significativo al suo utilizzo per la consegna dei geni. Inoltre, il nostro metodo sfrutta questa differenza di proprietà utilizzando l'esonucleasi per digerire frammenti di DNA lineari non reagiti o mal reagiti, purificando così il DNA circolare.

Abbiamo determinato che l'intervallo pratico della lunghezza del vettore di espressione è compreso tra 450 e 950 bp, dove raggiunge un'efficienza fino al 62% nella conversione del DNA lineare a doppio filamento di input (dsDNA) nei vettori di espressione circolari; il metodo potrebbe essere utilizzato anche con efficienza inferiore per frammenti un po' più lunghi. Per brevità, coerenza e per evitare confusione con la descrizione delle fasi di preparazione e del prodotto finale in questo documento, faremo riferimento a questo costrutto e metodo del vettore di espressione circolare del DNA come un vettore circolare, in maiuscolo e in corsivo.