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CTCF è un DNA

Nature volume 616, pages

Natura volume 616, pagine 822–827 (2023) Citare questo articolo

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Negli eucarioti, il DNA genomico viene estruso in anse dalla coesione1. Limitando questo processo, il fattore legante il DNA della proteina CCCTC (CTCF) genera domini topologicamente associati (TAD)2,3 che hanno ruoli importanti nella regolazione e nella ricombinazione dei geni durante lo sviluppo e la malattia1,4,5,6,7. Non è chiaro come il CTCF stabilisca i confini del TAD e in che misura questi siano permeabili alla coesione8. Qui, per rispondere a queste domande, visualizziamo le interazioni di singole molecole di CTCF e di coesione sul DNA in vitro. Mostriamo che CTCF è sufficiente per bloccare la coesione che diffonde, forse riflettendo il modo in cui la coesione coesiva si accumula ai confini del TAD, ed è anche sufficiente per bloccare la coesione che estrude il loop, riflettendo il modo in cui CTCF stabilisce i confini del TAD. CTCF funziona in modo asimmetrico, come previsto; tuttavia, il CTCF dipende dalla tensione del DNA. Inoltre, il CTCF regola l'attività di estrusione del cappio della coesione modificandone la direzione e inducendo il restringimento del cappio. I nostri dati indicano che CTCF non è, come precedentemente ipotizzato, semplicemente una barriera all'estrusione del loop mediata dalla coesione, ma è un regolatore attivo di questo processo, per cui la permeabilità dei confini del TAD può essere modulata dalla tensione del DNA. Questi risultati rivelano i principi meccanicistici su come CTCF controlla l'estrusione del loop e l'architettura del genoma.

Il ripiegamento del DNA genomico da parte della coesione ha ruoli importanti nell'organizzazione della cromatina, nella regolazione dei geni e nella ricombinazione1. La coesione appartiene alla famiglia dei complessi ATPasi di mantenimento strutturale dei cromosomi (SMC) che possono estrudere il DNA in anse, un'attività che è stata ricostituita in vitro per coesione, condensina e SMC5/SMC6 (rif. 9,10,11,12, 13,14). La coesione svolge anche una seconda funzione mediando la coesione dei cromatidi fratelli.

Nelle singole celle, gli anelli si trovano in posizioni variabili, suggerendo che gli anelli sono strutture dinamiche, la maggior parte delle quali sono in fase di estrusione15,16,17. Tuttavia, nelle misurazioni della popolazione cellulare, emergono modelli che rivelano che la maggior parte dei circuiti si formano all'interno dei TAD16,18,19. CTCF si trova ai confini del TAD18,19 ed è necessario per la loro formazione e per l'accumulo di coesione in questi siti2,3,20. CTCF ha regioni N- e C-terminali non strutturate che fiancheggiano 11 dita di zinco, molte delle quali riconoscono una sequenza asimmetrica di DNA e quindi posizionano CTCF direzionalmente sul DNA21,22. La maggior parte dei siti di legame CTCF sono orientati in orientamenti convergenti in modo che gli N terminali di CTCF siano rivolti verso l'interno dei TAD, suggerendo che CTCF funziona come un confine asimmetrico per l'estrusione del circuito mediata dalla coesione23,24,25. Coerentemente con questa possibilità, il terminale N del CTCF può legarsi alla coesione26 ed è necessario per l'isolamento TAD e l'ancoraggio del circuito in questi siti26,27,28,29.

Sono stati suggeriti diversi meccanismi su come il CTCF potrebbe prevenire l'estrusione del loop attraverso i confini del TAD (rivisto in precedenza8), vale a dire come barriera fisica (roadblock); legandosi alla coesione; prevenendo il rilascio di coesione dal DNA, promuovendo la sostituzione della subunità NIPBL attivante l'ATPasi della coesione con la sua controparte inattiva PDS5; inibendo direttamente l'attività dell'ATPasi della coesione; e favorendo l'intrappolamento del DNA all'interno di una struttura ad anello formata da tre subunità della coesione30. È stato anche proposto che CTCF converta la coesione in un enzima ad estrusione asimmetrica bloccando l'estrusione dell'anello nel sito legato a CTCF e consentendo alla coesione di continuare ad avvolgere il DNA nell'anello solo dall'interno del TAD26,31,32. Tuttavia, rimane irrisolto quale di questi meccanismi proposti sia utilizzato da CTCF e se CTCF sia sufficiente per bloccare l'estrusione del circuito mediante coesione. Rispondere a queste domande è di grande importanza, poiché il CTCF è necessario per controllare le interazioni potenziatore-promotore1, la riprogrammazione nucleare6, la ricombinazione dei geni del recettore dell'antigene4,5 e i tempi di replicazione del DNA33, e perché le mutazioni CTCF sono state implicate nella tumorigenesi7. I confini CTCF sono anche siti in cui le molecole di DNA replicate sono collegate da complessi di coesione, che mediano la coesione34.

<), tandem (>> and <<), and divergent (<>) manner. The percentages were obtained by multiplying the blocking probability of N- and C-terminal encounters in the force range 0.04-0.08 pN, as depicted in Fig. 2e, and normalizing to 100% (see Supplementary Note). Bar heights denote mean values. Error bars denote the error propagation after multiplication, given the 95% binomial confidence interval as depicted in Fig. 2e. The relative fraction of CTCF-anchored loops that we obtained from the single-molecule experiments are compared to published values extracted from Hi-C data3,63,64,65. b, Stalling force of cohesin. horizontal line median; boxes extend to the quartiles and the whiskers show the range of the data (median-1.5* interquartile range (IQR); median+1.5*IQR). Data from 2 independent experiments. c, The DNA tension measured at encounters of loop-extruding cohesin with the N- and C-terminus of CTCF and dCas9. The stalling force values from panel (b) is shown for comparison. N = 297, 184, 37, 66 for CTCF (N), CTCF (C), dCas9 and the stalling force measurements, respectively. d, The empirical survival function (1-CDF) of the data shown in panel c. Thick line represents the mean; shaded areas represent 95% confidence intervals. At the DNA tension of complete stalling at the CTCF N-terminus, 0.14 pN, the survival function decays to 53 \(\pm \) 16%, i.e. if loops would be halted by reaching the stalling force alone, one would expect ~53% of loops to exceed the DNA tension of 0.14 pN, which was not observed (compare blue line for stalling at the CTCF N-terminus and Fig. 2g). e, Ratio of the N-terminal and C-terminal blocking probabilities. N-terminal encounters block loop extrusion 3.6 ± 0.8 -fold (The bar height denotes the mean, error bars denote the error propagation after multiplication, given the 95% binomial confidence interval as depicted in Fig. 2g) more often than encounters from CTCF's C-terminal side, independently of DNA tension. N per bin for N-terminal (n) and C-terminal (c) encounters: 0.025-0.0415 pN: 70 (n), 72 (c); 0.0415-0.058 pN: 81 (n), 67 (c); 0.058-0.075 pN: 84 (n), 30 (c); 0.075-0.091 pN: 20 (n), 14 (c); 0.091-0.1075 pN: 40 (n), 6 (c); 0.119-0.142 pN: 3 (n), 0 (c). Sample sizes refer to biological replicates. f, Fraction of blocked molecules in the cohesin diffusion assay as a function of DNA tension (note that the DNA tension is constant in diffusion assays since no DNA loop is being extruded). The bar height denotes the mean, error bars denote the error propagation after multiplication, given the 95% binomial confidence interval. g, DNA tension of DNA molecules on which diffusing cohesin was blocked by N-terminally oriented CTCF (left; N = 74 from 2 independent experiments) or by C-terminally oriented CTCF (right; N = 27 from 5 independent experiments). Statistical significance was assessed by a 2-sided 2-sample Kolmogorov-Smirnoff test. h, Violin plot of DNA tension for DNA molecules on which diffusing cohesin was blocked by CTCF (left; N = 161 from 7 independent experiments) or repeatedly passed CTCF (right; N = 88 from 7 independent experiments). Statistical significance was assessed by a 2-sample Kolmogorov-Smirnoff test. Thick horizontal lines on boxplots denote median values, the box extends from the lower to upper quartile values and whisker limits denote the range of data within 1.5 times the interquartile range from the median./p>

 0.05, 2-sided 2-sample Kolmogorov–Smirnov test). i, Loop shrinkage rate, in comparison to cohesin loop extrusion rate (grey), and j, distribution of shrinkage time spans. Black dots represent step-wise shrinkage events that happen within one imaging time interval, i.e. 0.4 s. k, Absolute and l, relative loop size decrease for N- and C-terminal encounters in blue and red, respectively. Thick horizontal lines on boxplots denote median values, the box extends from the lower to upper quartile values and whisker limits denote the range of data within 1.5 times the interquartile range from the median. Data for N-/C-terminal encounters were collected from 13 and 3 independent measurements, respectively./p>