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Aug 05, 2023

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Nature Communications volume

Nature Communications volume 14, numero articolo: 1770 (2023) Citare questo articolo

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L'evoluzione diretta nei sistemi di visualizzazione di batteri o lieviti è stata utilizzata con successo per migliorare la stabilità e l'espressione dei recettori accoppiati a proteine ​​G per studi strutturali e biofisici. Tuttavia, diversi recettori non possono essere attaccati nei sistemi microbici a causa della loro complessa composizione molecolare o delle proprietà sfavorevoli dei ligandi. Qui, riportiamo un approccio per evolvere i recettori accoppiati a proteine ​​G nelle cellule di mammifero. Per ottenere clonalità ed espressione uniforme, sviluppiamo un sistema di trasduzione virale basato sul virus Vaccinia. Mediante una progettazione razionale delle librerie di DNA sintetico, evolviamo innanzitutto il recettore 1 della neurotensina per un'elevata stabilità ed espressione. In secondo luogo, dimostriamo che i recettori con architetture molecolari complesse e ligandi di grandi dimensioni, come il recettore dell'ormone paratiroideo 1, possono essere facilmente evoluti. È importante sottolineare che le proprietà funzionali dei recettori possono ora essere sviluppate in presenza dell'ambiente di segnalazione dei mammiferi, con il risultato che varianti del recettore mostrano un maggiore accoppiamento allosterico tra il sito di legame del ligando e l'interfaccia della proteina G. Il nostro approccio fornisce quindi approfondimenti sull'intricata interazione molecolare richiesta per l'attivazione del GPCR.

I recettori accoppiati a proteine ​​G (GPCR) comprendono la più grande famiglia di proteine ​​integrali di membrana e sono coinvolti nella regolazione di molti processi biologici1. I GPCR rilevano una grande varietà di ligandi, che vanno dalle piccole molecole alle grandi proteine, sul lato extracellulare. Per esercitare la loro funzione, i GPCR campionano un continuum di stati conformazionali, risultando in livelli di attività nulla o massima. I ligandi stabilizzano conformazioni distinte che mantengono il recettore in uno stato inattivo (nel caso degli agonisti inversi) o attivo (nel caso degli agonisti)2. Il cambiamento conformazionale indotto da un agonista nella tasca di legame del ligando viene trasmesso alla superficie intracellulare del recettore e determina l'attivazione delle proteine ​​G eterotrimeriche mediante scambio di GDP con GTP nella subunità Gα. Di conseguenza, le subunità Gα e Gβγ si dissociano e possono attivare processi di segnalazione a valle3,4. Data la loro ampia rilevanza fisiologica, i GPCR sono importanti bersagli farmacologici1 e la comprensione dei meccanismi struttura-funzione che portano all'attivazione dei GPCR è fondamentale per il futuro sviluppo di farmaci. Sebbene la flessibilità conformazionale sia essenziale per il corretto funzionamento del recettore, rappresenta un ostacolo per determinare sperimentalmente le strutture proteiche. Questa è stata la motivazione di sostanziali sforzi ingegneristici per rendere i GPCR utilizzabili per gli studi strutturali.

Abbiamo precedentemente ideato diverse strategie utilizzando l'evoluzione diretta per migliorare le proprietà biofisiche dei GPCR5,6,7,8. L'evoluzione diretta mira ad accelerare il processo di evoluzione naturale, cioè l'arricchimento di tratti desiderabili codificati in un pool di varianti genetiche, attraverso cicli iterativi di diversificazione e selezione genetica. In tal modo, la funzione proteica può essere alterata o creata de novo e, quindi, l’evoluzione diretta è diventata un metodo potente per sviluppare nuovi strumenti molecolari e terapie, ma applicato principalmente alle proteine ​​solubili. Per estendere questa metodologia ai GPCR, sono stati utilizzati organismi microbici come batteri e lieviti. Mediante trasformazione con plasmidi, possono assorbire, in media, una copia, in modo tale che, dopo che il plasmide ha stabilito il suo numero di copie, ciascuna cellula microbica è ancora "clonale". È stata dimostrata l'espressione di GPCR in forma funzionale nella membrana plasmatica del lievito o nella membrana interna di E. coli5,8,9 e quindi è garantito uno stretto accoppiamento di fenotipo e genotipo che è un requisito chiave per un'evoluzione diretta. Inoltre, è possibile ottenere elevati tassi di trasformazione nei microbi per rappresentare in modo efficiente diverse librerie genetiche. Utilizzando la selezione guidata dal numero di recettori che legano il ligando e quindi funzionali nella membrana, sono state generate una varietà di varianti GPCR stabili e ben espressive che sono state strumentali per studi strutturali e progetti di scoperta di farmaci10,11,12,13,14,15, 16,17.